單堿基編器是近年才出現(xiàn)新的基因編輯系統(tǒng)，被認(rèn)為是基因編輯技術(shù)3.0版本。該系統(tǒng)的基本原理是基于脫氨酶的作用，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）（Cytidine base editors, CBEs），或?qū)⑾汆堰剩ˋ）轉(zhuǎn)變成鳥嘌呤（G）（adenine base editors, ABEs），這種堿基間的相互轉(zhuǎn)換，不會(huì)引起雙鏈 DNA 的斷裂，利用其進(jìn)行基因編輯，更加有效而又安全。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會(huì)伴隨有DNA斷裂，后者會(huì)造成基因組的不穩(wěn)定性，對(duì)被編輯的生物機(jī)體帶來安全隱患。

單堿基編器出現(xiàn)以后，很快被廣泛地運(yùn)用于動(dòng)物、植物和人細(xì)胞的基因編輯。但是，以往的研究主要集中在單位點(diǎn)的堿基突變。而人類遺傳性疾病以及動(dòng)物遺傳性狀改變往往涉及到多個(gè)位點(diǎn)的單堿基突變，因此，對(duì)基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單堿基編輯才更有可能培育出能夠模擬人遺傳性疾病的大動(dòng)物模型和擁有優(yōu)良遺傳性狀的畜禽新品系。

近日，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組在Nature Communications發(fā)表了題為 Efficient base editing for multiple genes and loci in pigs using base editors 的研究論文。首次從細(xì)胞、胚胎及動(dòng)物三個(gè)層面探討了單堿基編輯器對(duì)豬多基因進(jìn)行同時(shí)點(diǎn)突變的可行性，并且通過體細(xì)胞核移植和胚胎注射兩種途徑獲得兩種單位點(diǎn)單堿基突變豬模型（杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和早衰癥豬模型）和一種三位點(diǎn)單堿基突變豬模型（重癥免疫缺陷豬模型）。該成果的應(yīng)用將加速生物醫(yī)藥相關(guān)的大動(dòng)物豬模型培育和農(nóng)業(yè)精準(zhǔn)育種。

該研究利用BE3和A3A-BE3兩種單堿基編輯工具，在細(xì)胞和胚胎層面，對(duì)基因組進(jìn)行三基因單堿基編輯，每個(gè)基因設(shè)計(jì)一條gRNA，突變成終止密碼子或者突變誘導(dǎo)新的mRNA剪切位點(diǎn)。在胎胚上，三基因同時(shí)被編輯效率最高可達(dá)50%。而細(xì)胞層面，三基因同時(shí)編輯分別為最高可達(dá)25%。在很多動(dòng)物體內(nèi)存在有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，這種基因系列相同的內(nèi)源性病毒往往以多拷貝的形式分布于染色體的不同位點(diǎn)。而豬內(nèi)源性病毒存在，給豬作為異種移植器官供體帶來安全隱患。本研究還對(duì)與豬內(nèi)源性病毒復(fù)制有關(guān)的pol基因單堿基突變，制造提前的終止密碼子，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)行單基因的多位點(diǎn)失活。通過二代測(cè)序分析，可以看到在體細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)，多拷貝的敲除率達(dá)到80%以上的，而在胚胎層面，71%病毒拷貝得到敲除。因此，本研究證明，單堿基編輯系統(tǒng)在細(xì)胞和胚胎水均可地實(shí)現(xiàn)多基因和或單基因多位點(diǎn)的高效堿基突變。

本研究進(jìn)一步通過胚胎注射以及體細(xì)胞核克隆的途徑分別培育出了單基因突變豬和多基因突變豬。獲得了含有單基因突變的杜氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy, DMD）豬模型以及早衰癥（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS）豬模型，均極好地模擬了病人的表型。所獲得的與免疫細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的三基因（RAG1、RAG2、IL2RG）純合突變豬的胸腺和脾臟發(fā)育有明顯缺陷，T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞缺失，免疫細(xì)胞不能進(jìn)行V(D)J基因組重排，具有典型的重癥免疫缺陷表型。由于豬的免疫系統(tǒng)與人非常相似，這種重癥免疫缺陷豬模型將成為生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要基因修飾工具豬。

該論文的共同通訊作者為賴良學(xué)研究員以及王可品副研究員。廣州生物醫(yī)藥與健康研究院博士研究生謝精科、葛維凱、栗楠、劉琪帥為共同第一作者。