一步法試劑（YSY Buffer）用于單個(gè)斑馬魚胚胎的基因型鑒定

1、斑馬魚早期發(fā)育胚胎的收集

收集發(fā)育至4-、8-、16-、32-、64-、128-、256-、512-、1K-、和4K-細(xì)胞期、以及50%外包期和75%外包期等不同發(fā)育時(shí)期的胚胎各3枚置于0.2 ml的PCR管中。盡可能吸去胚胎中的水溶液，然后將胚胎置于冰盒中備用?！?strong>適用于經(jīng)胚胎整體原位雜交后的單個(gè)胚胎的基因型鑒定】。

2、單個(gè)胚胎基因組DNA模板的制備

在盛有單個(gè)胚胎的PCR管中加入3.0 ml的YSY Buffer，快速離心確保溶液和胚胎均位于PCR管底，然后放入PCR儀中執(zhí)行60℃ 30 min、95℃ 10 min、16℃ 1 min的基因組DNA模板制備程序。

3、467bp的vps28基因組片段的直接擴(kuò)增

按常規(guī)方法配制PCR反應(yīng)液（每胚胎30 μl擴(kuò)增體系）27 μl含15 μl 2 × PCR Master mix、1.2 μl正向引物(引物序列為: GCCCTAGCTGGATATTTCAC；5 μM)、1.2 μl反向引物(引物序列為: CCCACCCTGAACTAAATGCA；5 μM)、9.6 μl超純水，混勻，快速離心。將配制好的27 μl PCR反應(yīng)液直接加入前述制備好的單個(gè)胚胎基因組DNA模板的PCR管中，快速離心后，放入PCR儀中，執(zhí)行如下DNA擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min、30 × (95 ℃ 15 sec, 58 ℃ 15sec, 72 ℃ 15 sec)、72 ℃ 5 min。

4、凝膠電泳觀測

制備1.5%的瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml 溴化乙錠），以移液槍吸取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入樣品孔中進(jìn)行常規(guī)電泳（電壓200 V，電泳15 min）。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀中觀測并拍照記錄。

圖一、單個(gè)斑馬魚發(fā)育早期胚胎vps28基因的467 bp基因組DNA片段的擴(kuò)增結(jié)果。64-細(xì)胞期的單個(gè)胚胎中可微弱的基因組DNA擴(kuò)增信號(hào)，自256-細(xì)胞期的單個(gè)胚胎則可見明顯擴(kuò)增產(chǎn)物，自4K-細(xì)胞期的單個(gè)胚胎的467 bp基因組DNA片段擴(kuò)增條帶則清晰明亮。